杂志名：theplantjournalpublishedonline31October
英文题目：IdentificationandfunctionalcharacterizationofditerpenesynthasesfortriptolidebiosynthesisfromTripterygiumwilfordii
做家：PingSu1,2,HongyuGuan1,2,YujunZhao1………,LuqiHuang1,*andWeiGao
单元：华夏中医科学院国度中药资本核心道地药材国度要点实习室教育基地
靠山：雷公藤甲素是一种松香型二萜，是以它属于与半日花烷型联系的超眷属，该超眷属的特性是经过络续的成对环化反响，由通常二萜前体(E,E,E)-香叶香叶二磷酸(GGPP)孕育潜在的碳氢链。这些酶首先由含有DxDD基序的II类二萜环酶催化，而后由含有独自DDxxD基序的I类二萜合酶催化。更详细地说，雷公藤甲素的孕育大概是经过GGPP的初始环化为共酰基二磷酸(CPP)，随后环化为阿比烷型二烯烯烃，后者进一步转折为雷公藤甲素。
图1雷公藤二萜类化合物的生物合成网络
实质：断定孕育感兴致化合物的机关和/或致使补偿添加的前提，能够显著辅助说明潜在的生物合成道路。在这边，做家报导了在这些教育物中饲喂miltiradiene能够添加雷公藤甲素的产量。另外，做家发觉在这些教育中能够向导雷公藤甲素的孕育，而后对其停止RNA测序(RNA-seq)以孕育转录组。本数据集经过亚细胞定位和生化懂得判定发觉了8种潜在的二萜合酶，发觉了两种亲密联系的CPP合成酶(CPSs)TwTPS7v2和TwTPS9v2，以及随后影响的一种miltiradiene合成酶TwTPS27v2。关键的是，TwTPS7v2和TwTPS9v2或TwTPS27v2的RNA干预(RNAi)低沉了雷公藤甲素的生成，这不单证了解miltiradiene做为前体的影响，并且也证了解这些二萜合成酶在这一紧急的二萜自然产品的生物合成中的影响。
采纳超高效液相色谱四极杆航行光阴质谱(UPLC/Q-TOFMS)对悬浮细胞教育物和教育基讨取物以及植物根、茎、叶和花机关停止懂得，对比悬浮细胞教育物与整株植物的化学繁杂性。悬浮教育物补偿的雷公藤甲素水准高于内地植物，这在教育基中特为广泛，其展现出相对简洁的植物化学特性，大概有助于雷公藤甲素和/或联系二萜的纯化。
图2雷公藤悬浮细胞和全植物器官讨取物的对比。
为了进一步研讨miltiradiene在雷公藤甲素生物合成中的潜在影响，这致使5破晓雷公藤甲素的补偿比对比显著添加(图3)。这说明，miltiradiene切实能够做为雷公藤甲素的前体，是以孕育这类烯烃的I类二萜合酶理当参加了这些二萜的生物合成。
图3用超高效液相色谱法测定以miltiradiene饲喂的悬浮细胞中雷公藤甲素的含量。
MeJA向导的雷公藤甲素水准在72h内显然高于对比，以后的光阴点不同更大;譬喻，在向导的悬浮细胞中，h后雷公藤甲素水准添加了3倍以上，到达lgg1(图4)。
图4茉莉酸甲酯(MeJA)向导雷公藤甲素在悬浮细胞中的补偿
基于MeJA添加雷甲素产量的本领，将向导的悬浮细胞用IlluminaHiSeq0平台停止深转录组测序。II类二萜环化酶的功用表征。序列懂得说明，总共8种二萜合酶均未呈现全长怒放浏览框(ORFs)。是以，行使向导悬浮细胞的RNA，经过50和30个cDNA结尾的赶快扩增(RACE)得到全长序列。这终究致使了6个不同全长二萜合酶的cDNA的克隆。对猜测的二萜合酶停止系统发育懂得（图5）。
图5雷公藤二萜合酶系统发育树。
为了断定倘若的II类二萜环化酶的功用，它们在大肠杆菌中异源表白，并以GGPP做为底物，经过体外无细胞实习停止了测试。在气相色谱-质谱(GC-MS)探测中，在探测实现后介入磷酸酶，别离对底物GGPP和任何产品(如CPP)停止去磷酸化，孕育香叶醇(GGOH)和copalol
为了断定这两种倘若的I类二萜合酶的功用，咱们将它们在大肠杆菌中重组表白，并与TwTPS7v2或TwTPS3v2(别离供应CPP或ent-CPP)贯串停止体外无细胞实习。TwKSL1和TwTPS16v2都没有孕育miltiradiene。相悖，两者都只对ent-CPP起影响。体外证明TwTPS27v2被判定为miltiradiene合酶。
图6采纳气相色谱-质谱法(GC-MS)对雷公藤萜类合成酶催化反响产品停止体外懂得。
图7本氏烟叶中雷公藤二萜合酶与GFP合并卵白的亚细胞定位
图8茉莉酸甲酯(MeJA)管教的悬浮细胞中雷公藤二萜合酶的相对表白。
将RNAiTwTPS7v2和/或TwTPS9v2与悬浮细胞教育物一同行使，为miltiradiene在雷公藤甲素生物合成中的影响供应了更直接的左证。RNAi致使TwTPS7v2和TwTPS9v2的转录水准下落了30%，而TwCPS2和TwTPS3v2的转录水准没有遭到影响，与空载体转折的对比教育物比拟，但雷公藤甲素的补偿下落了近50%。当RNAiTwTPS27v2的转录水准也只低沉了约30%，而TPS-b联系亚眷属成员TwTPS22v2、TwTPS23v2、TwTPS32的转录水准并没有低沉；但雷公藤甲素的补偿削减了约40%(图9)。
图9TwTPS7v2、TwTPS9v2、TwTPS27v2以及亲密联系的萜类合酶基因在RNAi悬浮细胞中的相对表白量及雷公藤甲素浓度
论断与议论：本文经过悬浮细胞教育不同向导剂添加了雷公藤中雷公藤甲素二萜类物资，并对其停止了转录组测序，挑选到了二萜合成联系的6个二萜环化酶，并停止体外酶促反响，而后停止了亚细胞定位，RNAi等实验，证了解miltiradiene这一核心体是孕育雷公藤甲素的前提物资。供稿
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(ZLQ)
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